维生素B6在红细胞内为磷酸吡多醛，后者作为机体不可缺乏的辅酶，可参与氨基酸，碳水化合物及脂肪的正常代谢。此外维生素B6还参与色氨酸将烟酸转化为5-羟色胺的反应。并可刺激白细胞的生长，是形成血红蛋白所需要的物质，所以维生素B6在运动饮料中常有添加。但长期大量应用维生素B6可致严重的周围神经炎，出现神经感觉异常，进行性步态不稳，手，足麻木，停药后症状虽可缓解，但仍可感觉软弱无力，甚至孕妇大量服用后可致新生儿产生维生素B6依赖综合征。因此，本文建立了一种高效液相色谱法测定运动饮料中维生素B6，并对该方法的不确定度进行了评定，以得到更加精确的结果。

　　1.测定程序：

　　1.1材料与方法：

　　1.1.1 仪器与试剂

　　岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪，CLASS-VP工作站，VWD检测器；赛多利斯CPA225D电子分析天平、超声波提取器、PH计及其他常用实验室仪器。

　　盐酸吡哆醇（维生素B6）标准品购自SUPELCO公司；1-癸烷磺酸钠，离子对试剂；三乙胺，分析纯；磷酸，分析纯；

　　甲醇，色谱纯；实验室用水均为超纯水。

　　1.2 色谱条件

　　色谱柱：Agilent Eclipse C18色谱柱（5μm，4.6×250mm）

　　流动相： 甲醇：1-癸烷磺酸钠缓冲液（取1.22g1-癸烷磺酸钠加水溶解后稀释到1000ml，加三乙胺3.0ml，用磷酸调节pH值至2.5）＝20︰80为流动相； 流速：1.0ml/min； 波长：275nm； 柱温：25℃；进样量：10μL

　　1.3 溶液制备

　　标准溶液：准确称量盐酸吡哆醇约25mg，置50ml容量瓶中，用甲醇＋水＋磷酸＝100+400+0.5混合溶液溶解并定容。然后分别稀释至浓度为：5、15、25、40、50、60、80、100μg/mL,作为标准曲线测试用溶液。

　　供试溶液：取20粒胶囊，取出内容物，研匀，称取1.5g试样于100mL容量瓶中，加入甲醇＋水＋磷酸＝100+400+0.5混合溶液约80mL，超声提取5min待溶液冷却至室温后以加入甲醇＋水＋磷酸＝100+400+0.5定容，摇匀，然后以3000r/min离心5min，上清液经0.45um滤膜过滤后作为供试液。

　　2.结果与分析

　　2.1专属性：在选定的分析条件下，维生素B6色谱峰附近不存在干扰物质，和附近成分分离度远大于1.5，标准品和样品保留时间吻合良好，方法专属性良好（如下图）。

　　图1 维生素B6标准品色谱图                 图2 动感运动饮料维生素B6测试色谱图

　　2.2 线性范围

　　对标准曲线系列溶液进行测试，结果如表一，维生素B6在5.40～108.00μg/mL范围内呈现良好的线性关系，回归方程：Y=15792.3X＋4169.1，r=0.99998（n=8）

　　表一：维生素B6标准溶液测试结果

　　校准溶液 浓度（μg/mL）峰面积平均峰面积校准溶液 浓度（μg/mL）峰面积平均峰面积

　　5.408572587312857958627754.00857051857507857211857256

　　16.2025921825910525932325921564.801031740102859410276731029336

　　27.0042948142946343221343038681.001285629128348112837511284287

　　43.20701364690962690297694208108.001709616170617217074781707755

　　2.3 精密度实验

　　在上述色谱条件下，取浓度为54.0μg/mL的标准溶液，连续进样6次，峰面积分别为857051、857507、857211、857158、857236、857294，RSD%＝0.02％。

　　2.4 重复性实验

　　取同一批动感运动饮料，平行配制9份供试液，连续测定，结果含量如表一。

　　表二：重复性实验测试结果

　　序号123456789平均值

　　样品重（g）1.48381.48031.47131.47521.48511.47471.47631.47381.47671.4775

　　结果（mg/kg）2.1952.1922.1982.1902.1882.1872.1892.1942.1962.192

　　其相对标准偏差RSD%＝0.18％

　　2.5 准确度实验（加标回收率）

　　取一未加维生素B6原料的空白辅料所制成的胶囊，取出内容物研匀后，先分别精密加入一定浓度的标准溶液后配制成三个浓度水平的供试液，测定回收率，结果如表三：

　　表三：准确度实验测试结果：

　　标准溶液 浓度/μg/mL43.2054.0064.80

　　12平均12平均12平均

　　回收浓度/μg/mL42.5542.8742.753.7653.5953.765.2865.0465.2

　　回收率/%98.599.298.899.699.299.4100.7100.4100.6

　　校正因子6.389e-56.342e-5―――6.329e-56.349e-5―――6.260e-56.283e-5―――

　　总平均回收率/%99.6校正因子RSD%0.74

　　2.6 最低检测限

　　配制一个维生素B6浓度为0.27μg/mL的溶液，经测试，其信噪比＝2.75，所以，当信噪比＝3时，得本法的检测限为2.9ng，当信噪比＝10时，得本法得定量限为9.8ng。

　　3.不确定度评定

　　实验过程如前文所述（图3），不确定度评定如下：

　　3.1建立数学模型

　　当结果以mg/kg表示时，

　　X=

　　其中，X为样品中维生素B6的含量（mg/kg或mg/L）

　　为由校准曲线读得的维生素B6的含量（μg/mL）

　　V为样品稀释总体积（mL）

　　m为样品量（g或mL）

　　3.2不确定度的来源分析

　　3.2.1主要不确定度因素分析：

　　由上述实验过程分析，本实验主要不确定度因素如下：

　　（1）样品称量引起的不确定度μ（mSam）（B类）（2）样品定容所带来的体积不确定度μ（VSam）（3）维生素B6标准品含量的不确定度μ（P）（B类）；（4）标准品称量所带来的质量不确定度μ（mSta）（5）标准溶液配制引起的体积不确定度μ（VSta）（B类）（6）最小二乘法线性拟合曲线测量样品时带来的不确定度（L）；（B类）（7）样品测定的重复性带来的不确定度（）（A类）详细见图4

　　3.3、各不确定度分量的计算

　　3.3.1 样品称量所带来的不确定度μ（mSam）（B类）

　　样品称量主要采用去皮回零后再称量样品，又制造商的说明书可知，该天平称重的主要不确定度来源为：可读性（数字分辨率）、重复性、温度变化造成的灵敏度偏移及由天平校准产生的不确定度分量：天平的灵敏度及其线性。其中由于天平称量时间较短，温度变化可忽略，故由温度变化造成的灵敏度漂移可忽略。

　　由说明书可知：天平可读性=0.1mg，可认为该项不确定度为矩形分布。

　　故该项不确定度μ可读（mSam）==0.0289mg

　　该天平的重复性（标准偏差）为0.1mg，故μ重复性（mSam）=0.1mg

　　该天平的线性允差为±0.2mg，该不确定度为矩形分布：

　　μ线性（mSam）==0.115mg

　　μ（mSam）==0.155mg

　　3.3.2 样品定容引起的体积不确定度μ（VSam）（B类）

　　该不确定度主要由以下三部分组成：

　　3.3.2.1样品溶液配制使用了一个50ml的容量瓶，为A级，50mL A级容量瓶在20℃时的容量为50±0.05mL,因为在有效的生产过程中标定值比极限值的可能性更高，故选择该容量的不确定度为三角形分布，所以μ容量（VSam）==0.0204mL。

　　3.3.2.2容量瓶使用温度和检定温度不一致带来的不确定度，实验室温度控制一般在20±5℃范围内，因水的膨胀系数远大于玻璃的膨胀系数故只考虑水的膨胀带来的不确定度，水的膨胀系数为，所以μ温度（VSam）＝±＝±0.0525mL

　　所以μ（VSam）＝＝0.0563mL

　　3.3.3维生素B6标准品含量的不确定度μ（P）（B类）

　　由标准品证书可知，该批标准品含量为99%，含量的不确定度为0.5％，所以，

　　μ（P）==0.495%。

　　3.3.4标准品称量所带来的质量不确定度μ（mSta）（B类）

　　因使用同一天平减量法称量标准品，标准品瓶+标准品的总重约为7.3g，而该天平的可读性为0.1mg，线性允差为±0.2mg，重复性为0.1mg,忽略掉灵敏度的影响，故

　　μ（mSta）===0.183mg

　　3.3.5标准溶液配制引起的体积不确定度μ（VSta）（B类）

　　该部确定度主要由以下两部分组成：

　　3.3.5.1标准储备液的配制需要用到1个50ml容量瓶，为A级，50mL A级容量瓶在20℃时的容量为50±0.05mL,因为在有效的生产过程中标定值比极限值的可能性更高，故选择该容量的不确定度为三角形分布，所以μ容量（VSta）==0.0204mL。另外由标准储备液配制标准曲线测定用标准溶液的不确定度将在最小二乘法曲线拟和时涵盖，故在这里不单独考虑。

　　所以μ容量（VSta）==0.0204mL。

　　3.3.5.2容量瓶使用温度和检定温度不一致带来的不确定度，实验室温度控制一般在20±5℃范围内，因水的膨胀系数远大于玻璃的膨胀系数故只考虑水的膨胀带来的不确定度，水的膨胀系数为，所以μ温度（VSta）＝±＝±0.0525mL

　　所以μ（VSta）＝＝0.0563mL

　　3.3.6线性拟合曲线测量样品时带来的不确定度μrel（L）（B类）

　　标准曲线线性系数r=0.99998，B1=15792.3，B0=4169.1，线性拟合方程Aj=B1Ci+B0

　　式中：Aj :  第 i个校准标准溶液的第j次峰面积

　　Ci：第i个校准标准溶液的浓度

　　B6 ：斜率

　　B0 ：截距

　　则，残差标准偏差

　　=49.95

　　样品浓度与标准浓度平均值偏差最大是样品2，浓度为68.789ug/ml，以该样品计。

　　μrel（L）=

　　=0.32％

　　3.3.7样品测定的重复性带来的不确定度μ （）（A类）

　　平行测量10份，测量覆盖本方法的全过程，数据如表二。

　　其标准不确定度，即μ（i）=s==0.00386mg/kg

　　一般报告为2个平行样的平均值，mg/kg

　　所以μ（）==0.00273mg/kg

　　3.4、合成标准不确定度

　　3.4.1 不确定度分量表

　　将各不确定度分量列于表三，其中小于最大的不确定度分量十分之一的分量可忽略不计。因此天平称量μ（VSam）及μ（mSta）均可忽略。

　　分量类别来源评价方法、分布量值μμrel（%）备注

　　μ（mSam）天平称量B类/矩形分布1477.5mg0.155mg0.0105忽略

　　μ（VSam）定容体积B类/三角形分布50mL0.0563mL0.113

　　μ（P）标准物质纯度B类/矩形分布99%0.495%0.50

　　μ（mSta）天平称量B类/矩形分布7.3g0.183mg0.0025忽略

　　μ（VSta）定容体积B类/三角形分布50mL0.0563mL0.113

　　μrel（L）线性拟合曲线B类/正态分布------0.32

　　μ （）重复性测定A类2.192mg/kg0.00273g/kg0.125

　　3.4.2 合成标准不确定度

　　相对合成标准不确定度：

　　μcrel=

　　==0.63%

　　合成标准不确定度：

　　μc==2.19mg/kg×0.63%=0.014mg/kg

　　3.5、计算扩展不确定度

　　取包含因子为k=2，则高效液相色谱法测定食品中维生素B6的方法的扩展不确定为

　　U=k×μc=2×0.014mg/kg≈0.03mk/kg，K=2。

　　3.6、结果表示及说明

　　本次测定的结果为：2.19±0.03mg/kg（k=2），本实验不确定主要来源于标准物质的不确定度。

　　4.讨论

　　由于目前动感运动饮料中维生素B6含量偏低，且其中含有大量其他杂质，现有方法在分离度及检测限无法达到要求，故我们对流动相及色谱柱进行了筛查，并对选定的色谱条件进行了优化，目前，该方法对动感运动饮料中维生素B6分析无需固相萃取，经过简单前处理即可进样，经该方法分析，维生素B6与其他杂质分离良好，定量准确，灵敏度高，回收率、重复性良好，且方法的不确定度主要来源于标准物质的不确定度，便于控制，故该方法可用于动感运动饮料的质量控制及后续类似运动饮料的配方开发。

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　　[5]郝荣辉，夏敏，谷学新 反相高效液相色谱同时测定动物营养液中B族维生素。现代科学仪器 ，2006，16（6）：81-83